因临床表现复杂、多样化，且婴儿常突发重症，故必须尽早确诊及时抢救。根据喂养史、乳母膳食史、临床表现，以及结合流行病史，可作出诊断。
疑有本病者，应立即给予维生素B1试验性治疗。本病在治疗后迅速好转，可作为确诊的有力依据。测定血中维生素B1浓度可明确诊断，但由于测定技术复杂，临床不易推广。亦可采用维生素B1负荷试验，若尿中维生素B1排出量减少，可协助诊断。
此外，检测全血丙酮酸和乳酸含量明显增高、红细胞转酮酶活性降低，均有助于诊断。
诊断上应注意与有类似症状的疾病相鉴别，如有呛咳、气急时与吸入性肺炎；初发症状有呕吐时与肥厚性幽门狭窄；脑型脚气病与中枢神经系统感染如脑炎、脑膜炎等；心脏型脚气病与引起急性心力衰竭的各种疾病如心内膜弹力纤维增生症、先天性心脏病等；周围性神经炎与多发性神经根炎、脊髓灰质炎等疾病相鉴别。
若临床上符合维生素B1缺乏症，经维生素B1治疗后好转，但停药后复发，应考虑遗传性丙酮酸羧化酶缺陷所致的维生素B1依赖症。
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